يعلمك هذا المقال كيفية اختيار عمود اللوني السائل

اللوني السائل هو الطريقة الرئيسية لاختبار محتوى كل مكون والشوائب في المواد الخام والوسيطة والمستحضرات ومواد التعبئة والتغليف، ولكن العديد من المواد ليس لديها طرق قياسية يمكن الاعتماد عليها، لذلك لا مفر من تطوير أساليب جديدة. في تطوير طرق الطور السائل، يعد العمود الكروماتوغرافي هو جوهر التحليل اللوني السائل، لذا فإن كيفية اختيار العمود الكروماتوغرافي المناسب أمر بالغ الأهمية. في هذه المقالة، سوف يشرح المؤلف كيفية اختيار عمود اللوني السائل من ثلاثة جوانب: الأفكار العامة والاعتبارات ونطاق التطبيق.

أ.الأفكار العامة لاختيار أعمدة الفصل الكروماتوغرافي السائل

1. تقييم الخواص الفيزيائية والكيميائية للحليلة: مثل التركيب الكيميائي، والذوبان، والاستقرار (مثل ما إذا كان من السهل أكسدتها/اختزالها/تحللها مائيًا)، والحموضة والقلوية، وما إلى ذلك، خاصة أن التركيب الكيميائي هو المفتاح عامل في تحديد الخصائص، مثل أن المجموعة المترافقة لديها امتصاص قوي للأشعة فوق البنفسجية ومضان قوي؛

2. تحديد الغرض من التحليل: ما إذا كان الفصل العالي، وكفاءة العمود العالية، ووقت التحليل القصير، والحساسية العالية، ومقاومة الضغط العالي، وعمر العمود الطويل، والتكلفة المنخفضة، وما إلى ذلك مطلوبًا؛

1. اختر عمودًا كروماتوغرافيًا مناسبًا: افهم التركيب والخصائص الفيزيائية والكيميائية للحشو الكروماتوغرافي، مثل حجم الجسيمات، وحجم المسام، وتحمل درجة الحرارة، وتحمل الرقم الهيدروجيني، وامتصاص المادة التحليلية، وما إلى ذلك.

1. اعتبارات لاختيار أعمدة اللوني السائل

سيناقش هذا الفصل العوامل التي يجب مراعاتها عند اختيار عمود كروماتوغرافي من منظور الخواص الفيزيائية والكيميائية للعمود الكروماتوغرافي نفسه. 2.1 مصفوفة الحشو

2.1.1 مصفوفة هلام السيليكا مصفوفة الحشو لمعظم أعمدة التحليل اللوني السائل هي هلام السيليكا. يتميز هذا النوع من الحشو بنقاء عالي، وتكلفة منخفضة، وقوة ميكانيكية عالية، ومن السهل تعديل المجموعات (مثل رابطة الفينيل، والرابطة الأمينية، والرابطة السيانو، وما إلى ذلك)، ولكن قيمة الرقم الهيدروجيني ونطاق درجة الحرارة الذي يتحمله محدودان: يتراوح نطاق الأس الهيدروجيني لمعظم حشوات مصفوفة هلام السيليكا من 2 إلى 8، لكن نطاق الأس الهيدروجيني للأطوار المرتبطة بهلام السيليكا المعدلة خصيصًا يمكن أن يصل إلى 1.5 إلى 10، وهناك أيضًا أطوار مرتبطة بهلام السيليكا معدلة خصيصًا تكون مستقرة عند درجة حموضة منخفضة، مثل Agilent ZORBAX RRHD Stablebond-C18، وهو مستقر عند درجة الحموضة من 1 إلى 8؛ الحد الأقصى لدرجة الحرارة لمصفوفة هلام السيليكا هو عادة 60 درجة مئوية، ويمكن لبعض أعمدة التحليل اللوني أن تتحمل درجة حرارة تصل إلى 40 درجة مئوية عند درجة حموضة عالية.

2.1.2 مصفوفة البوليمر تكون حشوات البوليمر في الغالب من البوليسترين- ديفينيل بنزين أو بولي ميثاكريلات. وتتمثل مزاياها في قدرتها على تحمل نطاق واسع من الأس الهيدروجيني - ويمكن استخدامها في نطاق من 1 إلى 14، كما أنها أكثر مقاومة لدرجات الحرارة المرتفعة (يمكن أن تصل إلى أكثر من 80 درجة مئوية). بالمقارنة مع حشوات C18 القائمة على السيليكا، فإن هذا النوع من الحشو يتمتع بقدرة أقوى على مقاومة الماء، كما أن البوليمر كبير المسام فعال جدًا في فصل العينات مثل البروتينات. وتتمثل عيوبها في أن كفاءة العمود أقل والقوة الميكانيكية أضعف من الحشوات القائمة على السيليكا. 2.2 شكل الجسيمات

معظم حشوات HPLC الحديثة عبارة عن جسيمات كروية، ولكنها في بعض الأحيان تكون جسيمات غير منتظمة. يمكن أن توفر الجسيمات الكروية ضغطًا أقل للعمود، وكفاءة أعلى للعمود، واستقرارًا وعمرًا أطول؛ عند استخدام المراحل المتنقلة عالية اللزوجة (مثل حمض الفوسفوريك) أو عندما يكون محلول العينة لزجًا، يكون للجزيئات غير المنتظمة مساحة سطح محددة أكبر، وهو أكثر ملاءمة للعمل الكامل للمرحلتين، والسعر منخفض نسبيًا. 2.3 حجم الجسيمات

كلما كان حجم الجسيمات أصغر، زادت كفاءة العمود وزاد الفصل، ولكن كلما كانت مقاومة الضغط العالي أسوأ. العمود الأكثر استخدامًا هو عمود حجم الجسيمات 5 ميكرومتر؛ إذا كانت متطلبات الفصل عالية، فيمكن اختيار حشو 1.5-3 ميكرومتر، مما يفضي إلى حل مشكلة فصل بعض المصفوفات المعقدة والعينات متعددة المكونات. يمكن لـ UPLC استخدام مواد مالئة بحجم 1.5 ميكرومتر؛ غالبًا ما يتم استخدام حشوات بحجم جسيمات 10 ميكرومتر أو أكبر للأعمدة شبه التحضيرية أو التحضيرية. 2.4 محتوى الكربون

يشير محتوى الكربون إلى نسبة الطور المرتبط على سطح هلام السيليكا، والذي يرتبط بمساحة سطح محددة وتغطية الطور المرتبط. يوفر المحتوى العالي من الكربون سعة عمود عالية ودقة عالية، وغالبًا ما يستخدم للعينات المعقدة التي تتطلب فصلًا عاليًا، ولكن نظرًا لوقت التفاعل الطويل بين المرحلتين، يكون وقت التحليل طويلًا؛ تتمتع الأعمدة الكروماتوغرافية ذات المحتوى المنخفض من الكربون بوقت تحليل أقصر ويمكن أن تظهر انتقائية مختلفة، وغالبًا ما تستخدم للعينات البسيطة التي تتطلب تحليلًا سريعًا والعينات التي تتطلب ظروف طور مائي عالية. بشكل عام، يتراوح محتوى الكربون في C18 من 7% إلى 19%. 2.5 حجم المسام ومساحة السطح المحددة

وسائط الامتزاز HPLC هي جزيئات مسامية، وتحدث معظم التفاعلات في المسام. لذلك، يجب أن تدخل الجزيئات إلى المسام ليتم امتصاصها وفصلها.

حجم المسام ومساحة السطح المحددة مفهومان متكاملان. حجم المسام الصغير يعني مساحة سطحية كبيرة، والعكس صحيح. يمكن لمساحة سطح محددة كبيرة أن تزيد من التفاعل بين جزيئات العينة والمراحل المرتبطة، وتعزز الاحتفاظ بها، وتزيد من تحميل العينة وسعة العمود، وفصل المكونات المعقدة. تنتمي الحشوات المسامية بالكامل إلى هذا النوع من الحشوات. بالنسبة لأولئك الذين لديهم متطلبات فصل عالية، يوصى باختيار مواد حشو ذات مساحة سطحية كبيرة محددة؛ مساحة سطح محددة صغيرة يمكن أن تقلل الضغط الخلفي، وتحسن كفاءة العمود، وتقلل من وقت التوازن، وهو مناسب لتحليل التدرج. تنتمي حشوات القشرة الأساسية إلى هذا النوع من الحشوات. على أساس ضمان الانفصال، يوصى باختيار مواد حشو ذات مساحة سطحية صغيرة محددة لأولئك الذين لديهم متطلبات كفاءة تحليل عالية. 2.6 حجم المسام والقوة الميكانيكية

يشير حجم المسام، المعروف أيضًا باسم "حجم المسام"، إلى حجم حجم الفراغ لكل وحدة جسيم. يمكن أن يعكس القوة الميكانيكية للحشو. القوة الميكانيكية للحشوات ذات المسام الكبيرة تكون أضعف قليلاً من الحشوات ذات المسام الصغيرة. تُستخدم الحشوات ذات حجم المسام الأقل من أو يساوي 1.5 مل/جم في الغالب لفصل HPLC، بينما تُستخدم الحشوات ذات حجم المسام الأكبر من 1.5 مل/جم بشكل أساسي في كروماتوغرافيا الاستبعاد الجزيئي وكروماتوغرافيا الضغط المنخفض. 2.7 معدل السد

يمكن أن تقلل التغطية من قمم المخلفات الناتجة عن التفاعل بين المركبات ومجموعات السيلانول المكشوفة (مثل الترابط الأيوني بين المركبات القلوية ومجموعات السيلانول، وقوى فان دير فالس والروابط الهيدروجينية بين المركبات الحمضية ومجموعات السيلانول)، وبالتالي تحسين كفاءة العمود وشكل الذروة . سوف تنتج المراحل المستعبدة غير المغطاة انتقائية مختلفة بالنسبة للمراحل المستعبدة المغطاة، وخاصة بالنسبة للعينات القطبية.

1. نطاق تطبيق أعمدة اللوني السائل المختلفة

سيصف هذا الفصل نطاق تطبيق الأنواع المختلفة من أعمدة التحليل الكروماتوغرافي السائل من خلال بعض الحالات.

3.1 العمود الكروماتوجرافي C18 ذو الطور المعكوس

العمود C18 هو عمود الطور العكسي الأكثر استخدامًا، والذي يمكنه تلبية اختبارات المحتوى والشوائب لمعظم المواد العضوية، وينطبق على المواد المتوسطة القطبية وضعيفة القطبية وغير القطبية. يجب تحديد نوع ومواصفات العمود الكروماتوغرافي C18 وفقًا لمتطلبات الفصل المحددة. على سبيل المثال، بالنسبة للمواد ذات متطلبات الفصل العالية، غالبًا ما يتم استخدام مواصفات 5 ميكرومتر * 4.6 مم * 250 مم؛ بالنسبة للمواد ذات مصفوفات فصل معقدة وقطبية مماثلة، يمكن استخدام مواصفات 4 ميكرومتر * 4.6 مم * 250 مم أو أحجام جسيمات أصغر. على سبيل المثال، استخدم المؤلف عمودًا بحجم 3 ميكرومتر * 4.6 مم * 250 مم للكشف عن اثنين من الشوائب السامة للجينات في سيليكوكسيب API. ويمكن أن يصل الفصل بين المادتين إلى 2.9 وهو أمر ممتاز. بالإضافة إلى ذلك، في إطار فرضية ضمان الفصل، إذا كان التحليل السريع مطلوبًا، غالبًا ما يتم اختيار عمود قصير يبلغ 10 مم أو 15 مم. على سبيل المثال، عندما استخدم المؤلف LC-MS/MS للكشف عن شوائب سامة للجينات في API فوسفات بيبيراكين، تم استخدام عمود 3 ميكرومتر * 2.1 مم * 100 مم. كان الفصل بين الشوائب والمكون الرئيسي 2.0، ويمكن إكمال الكشف عن العينة في 5 دقائق. 3.2 عمود الفينيل ذو الطور المعكوس

عمود الفينيل هو أيضًا نوع من أعمدة الطور المعكوس. يتميز هذا النوع من الأعمدة بانتقائية قوية للمركبات العطرية. إذا كانت استجابة المركبات العطرية المقاسة بعمود C18 العادي ضعيفة، فيمكنك التفكير في استبدال عمود الفينيل. على سبيل المثال، عندما كنت أقوم بتصنيع سيليكوكسيب API، كانت استجابة المكون الرئيسي التي تم قياسها بواسطة عمود الفينيل من نفس الشركة المصنعة ونفس المواصفات (جميعها 5 ميكرومتر * 4.6 مم * 250 مم) حوالي 7 أضعاف استجابة العمود C18. 3.3 عمود الطور العادي

كمكمل فعال لعمود الطور المعكوس، فإن عمود الطور العادي مناسب للمركبات ذات القطبية العالية. إذا كانت الذروة لا تزال سريعة جدًا عند الشطف بأكثر من 90% من الطور المائي في عمود الطور المعكوس، وحتى قريبة من ذروة المذيب وتتداخل معها، يمكنك التفكير في استبدال عمود الطور العادي. يتضمن هذا النوع من الأعمدة العمود الهيلي، والعمود الأميني، والعمود السماوي، وما إلى ذلك.

3.3.1 عمود الهيليك عادة ما يدمج عمود الهيليك مجموعات محبة للماء في سلسلة الألكيل المرتبطة لتعزيز الاستجابة للمواد القطبية. هذا النوع من الأعمدة مناسب لتحليل المواد السكرية. استخدم المؤلف هذا النوع من الأعمدة عند دراسة محتوى الزيلوز والمواد المرتبطة به ومشتقاته. يمكن أيضًا فصل أيزومرات مشتق الزيلوز جيدًا؛

3.3.2 العمود الأميني والعمود السماوي يشير العمود الأميني والعمود السماوي إلى إدخال تعديلات الأمينو والسيانو في نهاية سلسلة الألكيل المرتبطة، على التوالي، لتحسين الانتقائية للمواد الخاصة: على سبيل المثال، العمود الأميني هو خيار جيد لفصل السكريات والأحماض الأمينية والقواعد والأميدات. يتمتع عمود السيانو بانتقائية أفضل عند فصل المواد الهيكلية المهدرجة وغير المهدرجة بسبب وجود روابط مترافقة. يمكن في كثير من الأحيان تبديل العمود الأميني وعمود السيانو بين عمود الطور العادي وعمود الطور العكسي، ولكن لا ينصح بالتبديل المتكرر. 3.4 العمود اللولبي

العمود اللولبي، كما يوحي الاسم، مناسب لفصل وتحليل المركبات اللولبية، خاصة في مجال المستحضرات الصيدلانية. يمكن اعتبار هذا النوع من الأعمدة عندما لا تتمكن أعمدة الطور العكسي التقليدية وأعمدة الطور العادي من تحقيق فصل الأيزومرات. على سبيل المثال، استخدم المؤلف عمودًا حلزونيًا مقاس 5 ميكرومتر*4.6 مم*250 مم لفصل أيزومري 1,2-ثنائي فينيل إيثيلين ثنائي أمين: (1S, 2S)-1، 2-ثنائي فينيل إيثيلين ثنائي أمين و(1R, 2R)-1, 2 -ثنائي فينيل إيثيلين ثنائي أمين، وبلغت نسبة الفصل بين الاثنين حوالي 2.0. ومع ذلك، فإن الأعمدة اللولبية أكثر تكلفة من الأنواع الأخرى من الأعمدة، وعادةً ما تكون 1 وات+/قطعة. إذا كانت هناك حاجة لمثل هذه الأعمدة، فيجب على الوحدة توفير ميزانية كافية. 3.5 عمود التبادل الأيوني

أعمدة التبادل الأيوني مناسبة لفصل وتحليل الأيونات المشحونة مثل الأيونات والبروتينات والأحماض النووية وبعض المواد السكرية. وفقا لنوع الحشو، يتم تقسيمها إلى أعمدة التبادل الكاتيوني، وأعمدة التبادل الأيوني، وأعمدة التبادل الكاتيوني القوي.

تشتمل أعمدة التبادل الكاتيوني على أعمدة تعتمد على الكالسيوم وأعمدة تعتمد على الهيدروجين، وهي مناسبة بشكل أساسي لتحليل المواد الكاتيونية مثل الأحماض الأمينية. على سبيل المثال، استخدم المؤلف الأعمدة القائمة على الكالسيوم عند تحليل غلوكونات الكالسيوم وخلات الكالسيوم في محلول التنظيف. كان لكل من المادتين استجابات قوية عند 210nm = 210 نانومتر، ووصلت درجة الفصل إلى 3.0؛ استخدم المؤلف الأعمدة المعتمدة على الهيدروجين عند تحليل المواد المرتبطة بالجلوكوز. تتمتع العديد من المواد الرئيسية ذات الصلة - المالتوز والمالتوتريوز والفركتوز - بحساسية عالية تحت أجهزة الكشف التفاضلية، مع حد كشف منخفض يصل إلى 0.5 جزء في المليون ودرجة فصل تبلغ 2.0-2.5.

أعمدة التبادل الأنيوني مناسبة بشكل أساسي لتحليل المواد الأنيونية مثل الأحماض العضوية وأيونات الهالوجين؛ تتمتع أعمدة التبادل الكاتيوني القوية بقدرة أعلى على التبادل الأيوني وانتقائية، وهي مناسبة لفصل وتحليل العينات المعقدة.

ما ورد أعلاه هو مجرد مقدمة لأنواع ونطاقات التطبيق للعديد من أعمدة التحليل اللوني السائل الشائعة بالإضافة إلى تجربة المؤلف الخاصة. هناك أنواع خاصة أخرى من الأعمدة الكروماتوغرافية في التطبيقات الفعلية، مثل الأعمدة الكروماتوغرافية ذات المسام الكبيرة، والأعمدة الكروماتوغرافية ذات المسام الصغيرة، والأعمدة الكروماتوغرافية المتقاربة، والأعمدة الكروماتوغرافية متعددة الأوضاع، والأعمدة الكروماتوغرافية السائلة فائقة الأداء (UHPLC)، وأعمدة كروماتوغرافيا السوائل فوق الحرجة (UHPLC). SFC)، وما إلى ذلك. إنهم يلعبون دورًا مهمًا في مختلف المجالات. ويجب اختيار النوع المحدد للعمود الكروماتوغرافي وفقاً لبنية وخصائص العينة ومتطلبات الفصل والأغراض الأخرى.